摘要：为了尽可能避免毒性效应并安全使用天然产物，更全面的毒性认知已成为迫切需要。通常认为小分子代谢产物可以代表生物体的生理或病理状态，因此，基于代谢组学的毒理学研究既可以用于评价毒性，也可以鉴定天然产物的毒理学生物标志物，有助于指导临床用药并减少药物不良反应。近几十年来，代谢组学在中药单体成分、提取物和复方制剂诱导的肾毒性、肝毒性、心脏毒性和中枢神经系统的毒性评价中应用广泛。综述常用的代谢组学技术，包括样品制备、样品检测、数据处理和分析方法，以及基于代谢组学的天然产物毒理学研究等方面的进展，并对该研究的潜在问题进行探讨并对今后的发展方向进行展望。
天然产物从广义上讲包括生命产生的任何物质，通常包含有毒成分和活性成分。近年来，不断有因摄入含有有毒成分的天然物质而引起的中毒事件发生，且发生率逐年增高，诸如河豚中毒、毒蘑菇中毒、豆角中毒以及贝、螺类中毒等，中毒患者的结局指标包括严重的身体损伤甚至死亡。但由于天然产物含有的生物活性物质一直是许多药物的来源，特别是有超过50%的抗癌药物也来自天然产物，所以天然产物在疾病预防和治疗方面有着悠久的历史，而且在保健和慢性疾病治疗方面越来越受到重视[1]。天然产物对抵抗疾病的攻击极为重要，即使随着时代的进步科学技术有了很大进展，一些天然产物仍是药物和前体药物的必要组成部分，直接或间接地治疗疾病。但是，在不清楚有毒成分及其浓度和作用机制的前提下，天然产物的使用必须谨慎，需要进行可行且有效的探索。
近年来出现的代谢组学技术成为了研究天然产物，尤其是中药毒性成分的很好工具。代谢组学最早由Nicholson教授于年提出[2]，旨在对特定生物体或生物样品中的小分子代谢物进行系统的定性和定量分析，并描述外源物质干扰前后内源性代谢物的变化规律。它可以定量测量大量在生物系统中具有重要作用的低分子内源代谢物，包括氨基酸、肽、脂质、核酸、有机酸、维生素、硫醇和碳水化合物等，是系统生物学研究的重要组成部分[3]。代谢产物是细胞调控过程的最终产物，可被视为生物系统控制遗传或环境变化的最终反应[4]，深入了解复杂疾病生物化学途径中的整体变化可以为疾病的发病机制提供有价值的证据，并且代谢组学还有可能通过探究疾病的早期生物化学变化从而寻找到预测性的生物标志物[5]。另一方面，代谢组学采用的“自上而下”的策略来考虑整体情况下由干预引起的完整生物体的功能和代谢变化，是最适合中药多靶点、多系统作用特点的整体研究。
1代谢组学技术
生命科学的主要特征就是对于技术平台的依赖，代谢组学工作的开展同样离不开技术平台的支撑，尤其是高通量和大规模的分析技术，2种最常用的方法是质谱（MS）和核磁共振（NMR）波谱。两大技术多方法在代谢物鉴定和含量测定方面提供了互为补充的信息，如质子核磁共振（1H-NMR）法、气相色谱-质谱（GC-MS）法、毛细管电泳（CE）-MS法、高效液相色谱（HPLC）-MS法、超高效液相色谱（UPLC）-MS法和液相色谱（LC）-固相萃取（SPE）-NMR法等技术。不同的代谢组学方法已被应用于不同的中药研究中[6]。
MS是代谢组学中最常用的分析工具之一，具有高灵敏度（通常是pg级）和高数据采集速度等特点，能检测超过种内源性代谢物的特征。近年来基于MS方法的代谢组学研究大幅增加[7-8]，其先进的软件结合丰富的数据库使得准确测定及鉴定代谢物成为可能。由于生物样品基质的复杂性，在进行MS分析之前，特别是对代谢物进行定量时，通常需要先分离目标代谢物。因此，MS与色谱连用的分析平台应用广泛。常用的分离技术包括LC、GC和CE[9]。常见的MS技术包括四级杆、三重四级杆、离子阱、飞行时间（TOF）和OrbitrapTM。目前LC-MS在代谢组学中应用最为广泛[10]，其可直接检测生物样品代谢产物而不需要化学改性，多用于难以衍生化、不稳定及不易挥发且相对分子质量较大的样品。最新的LC-MS技术已经能够对大鼠血清中超过种代谢物进行绝对定量[11]，以及对体液、细胞和组织中超过种代谢物进行相对定量[12]。其缺点是分离效率不高、分析时间相对较长，没有统一的用于比对的数据库等。代谢组学应用中另一种比较稳定的方法是GC-MS，具有高分辨率及电子电离检测的高灵敏度等特点[13]，特别是对小分子代谢物，该方法是首选分析方法；易挥发、低相对分子质量代谢产物可直接分析，非挥发、极性代谢物需要在分析之前进行化学衍生化[14]。微量样本是研究中经常遇到的瓶颈，CE-MS所需样本少，并且分离样本速度和效率优于LC-MS和GC-MS，如Sato等[15]选择了CE-MS进行了水稻叶的代谢物检测，成功检测出88种代谢物。但CE-MS同样存在缺点，灵敏度和稳定性这两方面目前与LC-MS和GC-MS相比还有一段差距，而且如果做复杂体系如生物样品的组学分析，不容易定量，另外CE-MS在数据处理方面也存在一些问题。
NMR是代谢组学领域提供信息最丰富的技术之一。与MS不同，NMR允许以相同的测量方法对已知或者未知的代谢物结构验证及鉴别。NMR法非常适合研究代谢物中的复杂组分，由于NMR的谱峰与样品中每种成分的氢原子都是对应的，即样品中各成分的每个氢原子在光谱中都有其相关的峰，这样样品中各组分的相对含量都可以通过光谱中信号的相对强度反映出来。其主要特点是：（1）基本无偏倚性，不同于MS技术存在的离子化程度以及基质的干扰等问题，NMR对样品中所有物质检测的灵敏度相同；（2）无损伤性，样品检测前不需要复杂的前处理，不破坏样品的内部结构，因而便于原位和活体的动态检测；（3）可以设计多种编辑手段，实验方法比较灵活。然而，由于NMR方法的检测灵敏度较低，难以同时测定生物系统中共存性差异较大的代谢物，应用受限，其所需的硬件投资也较大，成本较高。
为了充分利用各种技术的优势，研究者将NMR和MS技术联合应用于代谢组学研究，形成了statisticaltotalcorrelationspectroscopy（STOCSY）的概念，不仅用于疾病相关代谢通路和毒理学研究，也为系统生物学中转录组、蛋白质组与代谢组的整合提供了重要机会。例如，Lenz等[16]将1H-NMR和LC-MS技术联合应用，研究了庆大霉素的肾毒性以及大鼠尿中内源代谢物的变化。结果发现了大鼠尿中葡萄糖增加、三甲胺氮氧化物（TMAO）减少等变化。
近年来，清华大学林金明教授团队开发了一种微流控芯片与MS的联用技术[17]，可以对细胞分泌物进行检测分析，以期得到细胞生命活动中扮演重要角色的物质的结构和含量信息。通过将基于芯片的SPE与在线电喷雾电离四极杆时间质谱仪（ESI-Q-TOF-MS）相结合，形成了一种表征药物代谢物的新代谢组学方法。其关键创新点在于将集成的微流体装置由用于细胞培养的圆形腔室和具有收缩末端的直通微通道组成，以包装固相材料，用于在质量分析之前进行样品净化和浓缩。利用此项技术，其研究了人肺上皮A细胞中维生素E的代谢。通过在线ESI-Q-TOF-MS成功检测到代谢物，实验灵敏度高，并且分析时间较短。
2代谢组学数据分析技术
代谢组学的数据研究策略可以分为2种：一种是靶向代谢组学（代谢靶标分析），另一种是非靶向代谢组学（代谢物轮廓分析）[18]。前者主要用于分析特定子集的化合物，分析已知生物化学路径或者特定种类的分子，产生的数据较为简单；而后者可以用高通量的分析手段在生物系统中进行全方位的代谢物监测，获得生物体的代谢轮廓，还可以通过比较不同实验组间的差异，寻找用于预测的生物标志物，所以后者产生的数据比较庞大复杂，代谢组数据的分析处理更为重要[19]。
在代谢组学应用中，数据处理一般包括信息提取、数据预处理、模式识别、模型验证以及代谢物筛选及鉴定等步骤[20-21]：（1）高通量的仪器分析得到的原始数据首先需要利用仪器分析软件或自定义程序进行信息提取，如MS及其联用技术多采用峰的积分结果作为变量提取，而NMR等波谱技术多采用等间距的切片或切块对谱图进行拆分，对区间内信号积分作为变量进行提取。（2）对得到的三维数据集进行预处理，一般包括数据的归一化及数据转化、中心化、标准化等步骤，是后续单维和多维统计分析、生物标志物筛选的重要前提[19]。（3）化学计量学的方法处理主要包括两大类：非监督性和监督性方法。最常见的非监督性方法为主成分分析法（PCA），最常见的监督性方法为偏最小二乘法（PLS）和正交偏最小二乘法（OPLS）。采用无监督的模式识别方法可以初步分析各组样本间的总体分布状况（如有无聚类、有无时间偏移趋势等）、自然聚集状态以及是否存在特异样本等；而采用监督性分析方法更倾向于提取利于样本分类的变量信息，也在很大程度上降低了系统噪声的干扰，提高了分类效能，更多用于构建预测模型和寻找代谢标志物。用于代谢组学分析的常用软件有ShimadzuClass-VP（用于PCA）、SIMCA-P（用于PCA和PLS-DA）和MicromassMarkertLynx（用于峰检测和峰对齐）。（4）代谢物的鉴定被认为是非靶标代谢组学的一大挑战。目前对NMR分析平台的物质鉴定通常利用一些商业化和实验室内部的软件可实现自动化，如ChenomxEslipse和BrukerAmix，然而与昂贵的分析软件相比，免费的在线数据库HMDB更受欢迎。而基于MS分析平台的鉴定目前缺乏统一标准，除了GC-MS平台已建立良好的标准图谱库可利用软件免费查询比对，其他平台一般多依靠分析人员的专业素质以及实验室积累的数据库，可以通过一些网上软件和数据库辅助鉴定。（5）代谢物的途径分析，这对于解释代谢物之间的相互作用和阐明可能的毒性机制是必要的，其中强大的网络工具MetaboAnalyst提供了大量的分析方法，包括数据处理、归一化、多元统计分析、生物标记和通路分析。MetaboAnalyst允许用户在线处理数据并接受由NMR、LC-MS或GC-MS产生的几种数据输入类型，这使得它在代谢组学中较为普及。常用的代谢物鉴定及途径分析数据库见表1[22]。
3基于代谢组学的天然产物毒性评估和生物标志物鉴定
3.1肾毒性
天然产物通常用于预防或治疗各种疾病。然而关于其作用机制和潜在毒性的现有数据则十分有限。肾毒性是天然产物最常见的毒副作用，包括电解质异常、蛋白尿、急性肾损伤、慢性肾病乃至死亡。然而，目前与这些天然产物相关的肾损伤和功能障碍的潜在机制仍不完全清楚。使用新型代谢组学分析方法进行全代谢谱分析在毒理学领域已越来越多地引起
本文编辑：佚名
转载请注明出地址 http://www.xungufenga.com/xgfsy/9549.html
